原标题：【文献解读】新英格兰杂志综述：NGS用于诊断疑似遗传病
N Engl J Med 2018; 379:1353-1362
临床上NGS目前常用于传统上进行基因检测的医疗实践中，例如，医学遗传学以及神经遗传学等医学领域。新诊断应用包括作为重症监护治疗（特别是新生儿和儿科）中的快速报告方法，以及在复杂疾病于病程早期使用。美国、中国和其它地区的大型项目正在探索和开发临床下一代测序在精准医学中的应用。这提示未来基因组数据将影响医疗决策，并且使用的患者多样且不断增长。
用于临床NGS的实验室技术已经在许多综述中提过。
1.sanger仍然是测序金标准。但从684个样本的5个基因测序结果来看，全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing，WES）测序结果的验证率已达99.97%；此外，对于高质量WES测序区域获得的不一致结果，WES数据正确的可能性高于Sanger测序数据。
2. Panel测序靶向与特定临床表型相关的几组基因，表型范围可能很窄（如家族性高胆固醇血症检测组合中的4个基因），也可能很广（如智力障碍检测组合中超过1,000个基因）。
3.全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）产生序列数据的区域是WES覆盖区域的50-100倍，包括调控区、内含子区和基因间区。与WES相比，WGS能够对某些区域有更一致的测序结果，但是临床上不推荐首选WGS，因为WGS配套的生物信息学工具远没有WES工具完善，WGS测序的费用仍然很高，且数据管理成本和分析费用很高；
4.测序目的是为了寻找与临床表型相关的基因变异；如表型直接相关变异未检出，次级发现（非与患者表型直接相关，但可致病，例如肿瘤相关基因BRCA1/2等）仍值得关注。
图1.NGS实验类型
每种实验类型都有一个相关的假阴性结果模式。例如，panel测序可能不包括某些突变基因，WES可能遗漏深度内含子剪接突变。另外，基因组的某些区域难以用任何现有方法进行测序。
由于NGS通量远高于sanger测序，通常可一次性得到数以千记的变异信息，因此必须对其进行过滤和优先级排序。如何筛选和评价这些变异与疾病的相关性变得十分重要。
1根据进化保守性、位点人群频率和蛋白质功能影响对位点进行评估；
2部分罕见疾病由于报道较少，可能出具报告时证据不足（注：从而给出可能致病或VUS，为后续解读带来挑战）；
3ACMG的五级变异分类方法被广泛使用，评级可分为致病性、可能致病性、可能良性、良性和意义未明的。ClinVar数据库采用ACMG标准对位点进行收录；
4临床检验实验室主要报告基因 - 疾病关联明确的变异；
5有不少优秀的数据库致力于建立基因 - 表型之间的关联，例如Gene-Matcher，DECIPHER和Phenome-Central。
1.在遗传背景清楚的情况下，基因panel通常有比WES、WGS更高的诊断率，因为它的测序深度更高，敏感度和特异性更好。在一项遗传性视网膜疾病的222基因panel筛查中，诊断率可达55%；在早发型癫痫（一种更具遗传异质性的表型）的172个基因panel筛查中，诊断率为30%，其中156个基因显示无异常；这也表明，增加panel的基因数，诊断率并不能呈线性增加；基因panel的成本可高可低，但一般低于WES；较昂贵的检测组合可能包含其它技术，例如MLPA、动态突变等。
2.在遗传背景不确定的情况下，WES诊断率可能更高；WES通常应用于Panel测序结果为阴性的患者，或鉴别诊断范围广泛的复杂表型患者；在一项50例周围神经病患者的研究中，Panel测序成功确诊了50例中的11例，而WES在此基础上又确诊了8例。在一个例子中报告，当先证者父母一起参与检测时，可增加16%的诊断率，但实际诊断率高度依赖于被检测人群、是否有其他家庭成员信息以及高可能性诊断的定义，最终的临床决策需要结合多方面信息。总体上，WGS和WES的诊断率可达25%-52%，可能远超其它诊断工具，例如全基因组芯片（Chromosome Microarray Analysis，CMA）；
1.经常使用NGS的临床医生，通常背后都有一套成熟而复杂的工作流程，用于获得患者统一，并在检测之前和之后为患者及家人提供咨询；由于不同临床检验实验室流程有差异，这些报告流程可能是特定检测或诊断实验室特有的，临床医生应检查和判断；
2.NGS测序报告可为临床诊断提供支持，改变未来的疾病风险，并未各种疗法的个体化定制提供信息；
3.患者知情同意是临床NGS的重要组成部分，适当的知情同意过程收集患者希望收到的次要结果的信息，并就发现意外风险变异的可能性提供咨询；知情同意还应阐明基因检测的潜在风险，例如隐私和歧视问题；
1.公共和私营承保机构对于临床NGS费用的支付意愿滞后于技术的发展；
2.承保机构在考虑是否纳入医疗保险时，考虑该测试是否为实验性的、研究性的或具临床必要性的；
3.下检测医嘱的临床医生需提供检测的合理性，和解释患者的受益；
4.NGS测序成本下降较快，需要对临床实用性和成本效益进行研究。
及时诊断可以改变治疗，为生育提供有关复发风险的准确信息，并可以通过结束长期艰难的诊断过程而节省医疗费用。
一项针对44名仅做先证者WES测序检测的患儿的研究表明，有23名(52%)被诊断，其中25%临床治疗发生了改变。另一项研究中，对63名重症婴儿进行了WES测序，患儿平均年龄33.1日，诊断率为51%。诊断结果影响了其中72%患儿的治疗。
另一项研究将42名患者的基因组测序与一组标准遗传检测进行比较，结果显示诊断率分别为43%和10%。在31%的患者中显示出临床应用价值百科，对于包括6名患者的一个患者组，因治疗改变节省的总费用估计为100万-200万美元。
1.NGS的发展速度，超过了用于制定标准和指南的现有资源。例如电子病历EMR中数据的存储、数据再分析和数据库的创建和管理。
2.临床意义不明（VUS）位点的再分析也十分重要。有研究表明，对于初步解读结果后12个月对WES测序结果在分析，产生了另外的诊断，并且发现这是一种符合成本效益的诊断方法。
基因组数据是精准医学的潜在组成部分，WES和WGS序列已被定义为终生临床资源。除上述用途外，这些数据还可能改善对常见疾病的风险估计，药物基因组学数据和迟发型疾病的诊断。
1.WES数据平均能检测1-7种携带者变异；
2.目前药物基因组学包括约130种药物，但对于各种变异对药物基因组学数据的应用价值百科，文献观点不一。即使是最有名的药物基因组研究药物华法林的研究，也尚未得出明确的指引性结论；
临床基因组和外显子组测序领域正在迅速发展，许多项目集中于提高诊断率。目前受关注的领域包括RNA检测的整合、结构变异的检测以及与检测方法（Panel、WES、WGS）相关的决策的改进。正在进行和计划中的基因组学和健康研究正在增进我们对基因组变异与疾病之间关系的了解。将临床NGS纳入常规医疗的未来临床计划可能预示着现有人类基因组和外显子组序列总数的大幅增加。费用、伦理学和标准方面的进展将有助于建立一条路线，通过这一路线将临床NGS和相关技术更广泛地纳入常规医疗实践中。考虑到过去5年的发展速度之快，所有医务人员都应该密切关注这一变革性领域发生的变化。
责任编辑：
